Pacienții cu cardiomiopatii ereditare asociate genei RBM20 sunt tratați în prezent, în general, conform schemelor utilizate în insuficiența cardiacă. Un nou studiu arată însă că variante genetice foarte apropiate pot produce mecanisme celulare profund diferite, ceea ce sugerează că, în viitor, tratamentul ar putea fi adaptat mutației exacte și modului în care aceasta afectează celulele inimii.
Cercetătorii au analizat două variante ale genei RBM20 care modifică aceeași poziție a proteinei, dar sunt asociate cu două forme diferite de cardiomiopatie. Una determină un profil caracteristic cardiomiopatiei dilatative, în timp ce cealaltă este asociată cu non-compactarea ventriculului stâng. Deși ambele reduc în final capacitatea țesutului cardiac de a se contracta, ele perturbă diferit circulația calciului, producerea energiei și conexiunile dintre celulele inimii.
Cardiomiopatiile reprezintă un grup de boli, de cele mai multe ori ereditare, în care structura sau funcționarea mușchiului cardiac este afectată. Inima nu mai poate pompa sângele suficient de eficient, iar pacienții pot prezenta dificultăți de respirație, oboseală, toleranță redusă la efort, palpitații și alte manifestări de insuficiență cardiacă.
Într-o parte dintre cazuri, boala este asociată cu variante ale genei RBM20, care produce o proteină implicată în procesarea ARN-ului. Mai exact, aceasta controlează procesul de splicing alternativ, prin care celulele selectează diferite segmente ale unei molecule de ARN pentru a produce forme distincte ale proteinelor.
RBM20 reglează mai multe gene importante pentru funcționarea inimii, printre care TTN, care codifică titina, și RYR2, implicată în eliberarea calciului necesar contracției cardiace.
Studiul a inclus membri ai două familii cu forme diferite de cardiomiopatie. Într-o familie, pacienții aveau cardiomiopatie dilatativă – DCM, caracterizată prin mărirea cavităților inimii și reducerea eficienței de pompare. În cealaltă familie, pacienții prezentau non-compactarea ventriculului stâng – LVNC, în care mușchiul cardiac are un aspect excesiv de trabeculat, cu adâncituri și zone insuficient compactate.
Ambele boli erau asociate cu modificarea aminoacidului arginină din poziția 634 a proteinei RBM20. În DCM, arginina era înlocuită cu triptofan, rezultând varianta p.R634W. În LVNC, aceeași arginină era înlocuită cu leucină, rezultând varianta p.R634L.
Diferența dintre cele două proteine este minimă, însă consecințele celulare au fost considerabil diferite.
Homeostazia calciului, mecanism central al disfuncției cardiace asociate RBM20
Unul dintre principalele procese afectate de cele două variante a fost homeostazia calciului, adică modul în care celulele cardiace eliberează, utilizează și stochează calciul.
În cardiomiocite, calciul are un rol esențial în fiecare bătaie a inimii. La începutul contracției, acesta este eliberat din depozitele interne ale celulei și activează fibrele musculare. Ulterior, este transportat înapoi, permițând relaxarea și pregătirea pentru următoarea contracție.
Cercetătorii au descoperit că variantele RBM20 afectează acest mecanism în direcții aproape opuse.
Cardiomiopatia dilatativă este asociată cu pierderi anormale de calciu
În celulele cu varianta p.R634W, asociată cardiomiopatiei dilatative, calciul se scurgea anormal din depozitele intracelulare chiar și în repaus.
Cardiomiocitele prezentau:
- pierderi crescute de calciu;
- o amplitudine mai redusă a semnalului de calciu din timpul contracției;
- o forță de contracție diminuată;
- o distanță mai mare între reticulul sarcoplasmatic și mitocondrii.
Reticulul sarcoplasmatic este principalul depozit de calciu al cardiomiocitelor, iar mitocondriile produc energia necesară contracției. Relația spațială apropiată dintre aceste structuri permite coordonarea semnalelor de calciu cu producția energetică.
În celulele DCM, această apropiere era perturbată. Rezultatul este compatibil cu un mecanism de decuplare mecano-energetică, în care cererea de energie a contracției nu mai este sincronizată eficient cu producția mitocondrială.
Acest profil seamănă cu mecanismele observate în mod obișnuit în insuficiența cardiacă cu fracție de ejecție redusă.
Non-compactarea ventriculară implică hiperactivare metabolică și defecte ale conexiunilor celulare
În celulele cu varianta p.R634L, asociată non-compactării ventriculului stâng, cercetătorii au observat un profil aproape opus.
Cardiomiocitele prezentau:
- semnale de calciu mai intense;
- eliberarea și reabsorbția mai rapidă a calciului;
- niveluri crescute de cAMP;
- activarea crescută a proteinelor PKA și CAMK2D;
- concentrații mai mari de calciu mitocondrial;
- respirație mitocondrială intensificată.
Celulele se aflau astfel într-o stare de hiperactivare funcțională și metabolică, inclusiv în repaus. Ele consumau mai multă energie și aveau o circulație accelerată a calciului. Cu toate acestea, forța de contracție a țesutului cardiac a rămas redusă. Cercetătorii consideră că hiperactivarea ar putea reprezenta un mecanism compensator: celulele individuale încearcă să lucreze mai intens pentru a compensa un defect structural al țesutului.
Analizele ultrastructurale au arătat că desmozomii, structuri care leagă cardiomiocitele și permit transmiterea forței între ele, erau mai scurți, iar distanța dintre celule era crescută.
Au fost identificate și modificări ale procesării genei JUP, care codifică plakoglobina, o proteină importantă pentru integritatea desmozomilor. Prin urmare, deși cardiomiocitele individuale erau hiperactive, forța produsă nu putea fi transmisă eficient la nivelul întregului țesut.
Modele cardiace derivate din celule stem pentru studierea mecanismelor bolii
Pentru a reproduce boala în laborator, cercetătorii au folosit probe de sânge și piele provenite de la pacienți. Celulele au fost reprogramate în celule stem pluripotente induse – iPSC, care pot fi ulterior transformate în diferite tipuri de celule.
În acest caz, ele au fost diferențiate în cardiomiocite capabile să bată spontan.
Au fost utilizate trei modele:
- cardiomiocite individuale;
- structuri tridimensionale de tip cardiosferă;
- mici fragmente de țesut cardiac artificial.
Modelele 3D au permis observarea modului în care celulele se conectează, se compactează și generează forță împreună. În ambele forme de cardiomiopatie, țesuturile artificiale au produs o forță de contracție mai mică decât modelele fără mutație.
De asemenea, ambele variante RBM20 au fost asociate cu dezorganizarea sarcomerelor, unitățile structurale care permit contracția mușchiului cardiac, și cu procesarea anormală a unor gene precum TTN și RYR2.
Tehnologia CRISPR/Cas9 a confirmat rolul cauzal al variantelor RBM20
Cercetătorii au utilizat tehnologia CRISPR/Cas9 pentru a corecta variantele genetice din celulele pacienților. După repararea mutațiilor, majoritatea anomaliilor observate au fost reduse sau eliminate. Localizarea proteinei RBM20, organizarea sarcomerelor, procesarea ARN-ului și funcționarea calciului s-au apropiat de valorile întâlnite în celulele de control.
Echipa a introdus apoi varianta asociată DCM într-o linie celulară provenită inițial din modelul LVNC, după corectarea mutației. Noile celule au dezvoltat caracteristici similare cardiomiopatiei dilatative. Rezultatul sugerează că substituția exactă a aminoacidului contribuie direct la determinarea mecanismului bolii și nu reprezintă doar un marker asociat.
Verapamilul și inhibarea CAMK2D, evaluate ca strategii terapeutice țintite
În cadrul studiului au fost testate și mai multe intervenții farmacologice. Unul dintre medicamentele evaluate a fost verapamilul, un blocant al canalelor de calciu utilizat în anumite tulburări de ritm cardiac și alte afecțiuni cardiovasculare.
În modelul LVNC, verapamilul a redus viteza excesivă a circulației calciului și a îmbunătățit parțial forța de contracție a țesutului cardiac artificial. În celulele cu cardiomiopatie dilatativă, verapamilul și metoprololul au redus pierderile anormale de calciu din depozitele intracelulare.
A fost testat și un inhibitor experimental al CAMK2D, care a redus amplitudinea excesivă a semnalului de calciu și activitatea metabolică din celulele LVNC.
Totuși, rezultatele sunt preclinice și nu justifică utilizarea imediată a acestor intervenții la pacienți. Verapamilul poate reduce forța de contracție a inimii și este în general contraindicat în insuficiența cardiacă cu fracție de ejecție redusă. Autorii sugerează că medicamentul ar putea fi investigat în viitor doar în contexte atent selectate, posibil în stadii timpurii ale bolii, înainte de apariția insuficienței cardiace severe.
Varianta genetică exactă ar putea ghida medicina personalizată în cardiomiopatii
Studiul arată că diagnosticul general de „cardiomiopatie asociată RBM20” poate include mecanisme biologice foarte diferite.
Într-un caz, celulele pierd calciu și dezvoltă un profil apropiat de insuficiența cardiacă clasică. În celălalt, cardiomiocitele sunt hiperactivate și consumă multă energie, dar legăturile dintre ele nu permit transmiterea eficientă a forței.
În prezent, acești pacienți sunt tratați în principal conform recomandărilor generale pentru insuficiența cardiacă. Noile rezultate sugerează însă că testarea genetică detaliată ar putea avea, în viitor, un rol nu doar în confirmarea diagnosticului și evaluarea riscului, ci și în alegerea tratamentului.
Modelele obținute din celule stem ale pacienților ar putea permite testarea medicamentelor în funcție de mecanismul individual al bolii. Astfel, abordarea terapeutică ar putea evolua de la tratamentul uniform al insuficienței cardiace către o formă de medicină personalizată, adaptată variantei genetice exacte și efectelor sale celulare.